Diagnóza botulismu je založena na identifikaci Clostridium botulotoxinu v laboratoři a na pozorování klinických symptomů, i když jsou někdy nespecifické. Nemoc lze ve skutečnosti zaměňovat s Guillain-Barrým syndromem, poliomyelitidou, cévní mozkovou příhodou, myasthenia gravis a paralýzou klíšťat.
V potravinovém botulizmu jsou důležité neuromuskulární poruchy a požití potenciálně kontaminovaných potravin. Současná manifestace u nejméně 2 pacientů, kteří jedli stejné jídlo, zjednodušuje diagnózu. Potvrzení se získá izolací mikroorganismu kultivačním testem suspektních vzorků potravin nebo výkalů pacienta a identifikací botulotoxinu v potravinách nebo biologických materiálech (jako je krev, žaludeční šťáva a zvracení).
V botulismu rány to naopak potvrzuje diagnóza sérového toxinu nebo izolace Clostridium botulinum ze vzorku kožních lézí.
